NMY51感受態細胞

NMY51感受態細胞

產品規格CAT#: BFNC86060-01(10×100ul)/BFNC86060-02(50×100ul)

NMY51 Competent Cell:                                     100μl/支              保存： -80℃（3個月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個月）

基因型
MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)₈-lacZ, ade2::(lexAop) ₈-ADE2, GAL4

產品說明

DUAL membrane系統是DUAL systems BioTech公司開發的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術，它利用分離的泛素系統 (split-ubiquitin)直接檢測天然狀態下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上*的檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統。此系統采用NMY51酵母菌株，可直接轉化質粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株Transformation marker為：trp1，leu2-3，報告基因為：HIS3，ADE2和 lacZ，先通過營養缺陷型報告基因 (HIS3，ADE2)進行選擇性生長篩選，進一步通過 LacZ報告基因進行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個獨立的報告基因，受不同啟動子的調控，降低假陽性幾率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質的 N端，然后被泛素專一性蛋白酶 (UBPs)識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人為地將泛素 Nub的 3位異亮氨酸突變為甘氨酸 (NubI 突變為 NubG)。這樣與 Cub的親合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我結合或接近的可能性。其次，將Cub部分與人工合成的 LexA-VP16轉錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結合，UBPs也不能識別分離的泛素，轉錄激活因子也不會被切下來。后，將要檢測的蛋白質分別與NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey發生相互作用，就會促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs識別，導致 LexA-VP16的解離，進入核內，從而激活報告基因的轉錄。 此系統可使用四種Bait質粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標志均為LEU；三種Prey質粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標志均為TRP。

青旗生物的NMY51感受態細胞經特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，pGADT7質粒檢測轉化效率>10⁴cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的NMY51感受態細胞，依次加入預冷的目的質粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5min,快速冰浴，重復一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)。

2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養48-96 h。

NMY51感受態細胞

注意事項

1. 感受態細胞盡量在冰上融化。

2. 轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

3. 同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

4. NMY51酵母菌株對高溫敏感，適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養可見直徑1 mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養可見直徑1 mm克隆。